产品货号：
YTB3117
中文名称：
α-淀粉酶活性检测试剂盒
英文名称：
α-Amylase Activity Assay Kit
产品规格：
100T|500T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种基于亚乙基-对硝基苯麦芽七糖(EPS-G7)，利用吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆、尿液等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清等样品中α-淀粉酶活性进行检测的试剂盒。通常0.5～5μL血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的检测。
| 组分 | 100T | 500T |
| BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay | 20mL | 100mL |
| Amylase Assay Buffer | 20mL | 100mL |
| Substrate | 200μL | 1mL |
| Enzyme Solution | 200μL | 1mL |
| Positive Control (50X) | 50μL | 250μL |
| Nitrophenol Standard (50mM) | 200μL | 1mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
本试剂盒的检测原理请参考图1。在α-淀粉酶的作用下，亚乙基-对硝基苯麦芽七糖(Ethylidene-pNP-G7/EPS-G7)水解生成对硝基苯麦芽三糖/对硝基苯麦芽四糖/对硝基苯麦芽三糖和对硝基苯麦芽四糖，生成的对硝基苯麦芽三糖在α-葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖和黄色的对硝基苯酚。样品中α-淀粉酶的活性越高，催化产生的黄色的对硝基苯酚越多，再通过检测对硝基苯酚在405nm的吸光度来最终计算样品中α-淀粉酶的活性。吸光度与样品中α-淀粉酶的活性成正比。
图1.α-淀粉酶活性检测试剂盒检测原理图。
- 本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒提供了α-淀粉酶的反应产物对硝基苯酚的标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2A)，计算出样品中的α-淀粉酶的活性。本试剂盒在样品体积为50μL时，对硝基苯酚标准曲线在0.005～5mM浓度范围内有良好的线性关系，即可以检测活性低至0.167mU/ml的α-淀粉酶，α-淀粉酶在0.167-167mU/ml范围内有良好的线性关系。
- 本试剂盒能特异性检测α-淀粉酶。淀粉酶主要有3种，分别为α、β、γ淀粉酶，其适宜的反应温度、pH和酶反应产物均不相同。本试剂盒使用α-淀粉酶的特异性底物，同时经过优化，相应的Assay Buffer和pH仅适合α-淀粉酶与底物进行反应，从而保证本试剂盒特异性的仅检测α-淀粉酶。
- 本试剂盒检测方法灵活，检测速度快。本试剂盒可快速、简便地测量样品中的α-淀粉酶活性，整个检测过程约30分钟即可完成。
本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统。
图2．α-淀粉酶活性检测试剂盒用于对硝基苯酚标准品、阳性对照及小鼠肝脏裂解样品的检测效果。50μL不同浓度的对硝基苯酚标准品、阳性对照和25倍稀释的小鼠肝脏裂解样品，加入100μL Amylase检测工作液混匀，25℃孵育30分钟，测定A405。图A为本试剂盒对标准品对硝基苯酚的检测效果图，在0.005～5mM浓度范围内有良好的线性关系；图B为对阳性对照和约37μg蛋白量的小鼠肝脏裂解样品的检测效果图。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
- Amylase Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。
- Nitrophenol Standard (50mM)如果有结晶析出会影响后续反应，需要在50～80℃水浴加热10～20分钟，使其完全溶解。
- 血清、血浆等血液样品如果在4℃保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。
- Nitrophenol Standard (50mM)对人体有毒，操作时请特别小心，并确保有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
- 样品的准备：
- 血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟～2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
- 细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100～500×g,5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100～200μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5～10分钟以充分裂解细胞。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，使用组织研磨仪或玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
- 细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
- 血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟～2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
- 试剂盒的准备：
- 融解BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay和Amylase Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。Nitrophenol Standard (50mM)如果有结晶析出，需要在50～80℃水浴孵育10～20分钟，使其完全溶解。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
- Amylase检测工作液的配制：按照每个检测反应100μL的体积配制适量的Amylase检测工作液。均匀混合96μL Amylase Assay Buffer、2μL Substrate、2μL Enzyme Solution，即可配制成100μL Amylase检测工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Amylase检测工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Amylase检测工作液如果置于4℃或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。
样品(μL) 1 10 20 50 Amylase Assay Buffer 96 960 1920 4800 Substrate 2 20 40 100 Enzyme Solution 2 20 40 100 Amylase检测工作液 100 1000 2000 5000
- 融解BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay和Amylase Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。Nitrophenol Standard (50mM)如果有结晶析出，需要在50～80℃水浴孵育10～20分钟，使其完全溶解。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
- 样品测定：
- 对硝基苯酚标准曲线设置：取20μL Nitrophenol Standard (50mM)，加入180μL Amylase Assay Buffer，混匀，配制成浓度为5mM的Nitrophenol Standard。分别取5mM的Nitrophenol Standard溶液0、0.5、1、2、5、10、20、50μL加入96孔板的标准品孔中，并用Amylase Assay Buffer补足至50μL，此时标准曲线的浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mM。
- 阳性对照的设置：取适量Positive Control(50X)，按照1:49的比例用Amylase Assay Buffer稀释成1X溶液，然后取50μL加入96孔板作为阳性样品。例如取阳性对照2μL，加入Amylase Assay Buffer 98μL，混匀后取50μL加入96孔板作为阳性样品。
- 加1～50μL样品或稀释后的样品到96孔板样品孔中，并相应地加入Amylase Assay Buffer至样品孔中，补足至50μL。同时设置仅含Amylase Assay Buffer的孔为空白对照。
- 为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品中α-淀粉酶的大致活性。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者样品的量。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为20μL，则n=10×50/20=25)。
- 对于血清、组织裂解液上清等复杂样品，建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验，在适当的稀释倍数时，样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果，选取适宜的稀释倍数用于后续的测定，否则即使信号值在标准曲线的线性范围内，也可能无法得到理想的检测结果。
- 各孔加入Amylase检测工作液100μL，混匀。
- 立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A405，此时记录为0分钟读值A1。
- 25℃反应20～30分钟，反应时间记为T，测定A405，记为A2。信号的增强取决于α-淀粉酶催化产生的对硝基苯酚量，ΔA=A2–A1。
- 为取得最佳的检测效果，反应时间可以根据待测样品中的α-淀粉酶活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于α-淀粉酶活性较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为4分钟或5分钟；对于α-淀粉酶活性较低的样品，可以延长测定总时间为45分钟至60分钟，对应的测定间隔时间设为5或10分钟。也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取检测数据中前期一段时间内呈线性的数据用于分析和计算。
- 建立对硝基苯酚标准曲线，将ΔA代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中α-淀粉酶催化产生的对硝基苯酚浓度B。对硝基苯酚标准曲线可以参考图2A，在0.005～5mM浓度范围内有良好的线性关系。α-淀粉酶的计算公式如下：
α-Amylase Activity (U/ml)=B×n/T- B为步骤3g根据标准曲线确定的对硝基苯酚浓度(mM)；
- n为步骤3c样品总稀释倍数；
- T为步骤3f的反应时间(min)。
- B为步骤3g根据标准曲线确定的对硝基苯酚浓度(mM)；
- 对硝基苯酚标准曲线设置：取20μL Nitrophenol Standard (50mM)，加入180μL Amylase Assay Buffer，混匀，配制成浓度为5mM的Nitrophenol Standard。分别取5mM的Nitrophenol Standard溶液0、0.5、1、2、5、10、20、50μL加入96孔板的标准品孔中，并用Amylase Assay Buffer补足至50μL，此时标准曲线的浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mM。
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